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Acabas de ejecutar un método de gradiente que funcionó perfectamente la semana pasada. Los estándares de calibración parecen limpios, pero el cromatograma de la muestra muestra un pico adicional a los 23,8 minutos. Se reemplaza la columna, se prepara un buffer nuevo y se verifica el detector. El pico todavía está ahí. Luego intercambias el agua que pasa a la fase móvil y el artefacto desaparece. Esa es la realidad de la cromatografía líquida de alta resolución: la pureza del agua se encuentra debajo de cada separación y, cuando cambia, el método cambia con ella.
La pureza del agua afecta la calidad de los datos de HPLC de cuatro maneras prácticas: estabilidad de la línea base, forma del pico, reproducibilidad de la retención y vida útil del instrumento. Los contaminantes involucrados pueden ser moléculas orgánicas, iones disueltos, partículas o microbios. Incluso una pequeña cantidad de un tipo de impureza puede producir consecuencias desproporcionadas con respecto a su concentración.
Contenido
- 1 Los principales efectos de la pureza del agua en HPLC
- 2 Lo que realmente significan "grado HPLC" y agua tipo 1
- 3 La elución en gradiente hace visibles las impurezas del agua
- 4 Hábitos diarios que protegen la pureza del agua
- 5 Los aditivos convierten un problema del agua en un problema de método
- 6 La pureza comienza con el proveedor
- 7 Trate el agua como parte del método
Los principales efectos de la pureza del agua en HPLC
En un sistema HPLC, el agua es un reactivo, no un fondo pasivo. Transporta el tampón, disuelve la muestra y contribuye al fondo del detector. Por lo tanto, las impurezas del agua pasan directamente a la señal analítica. La siguiente tabla resume los contaminantes más comunes y sus efectos.
| Contaminant | Ejemplos o fuente | Efecto en HPLC |
|---|---|---|
| Orgánicos disueltos | Sustancias húmicas, plastificantes, residuos de limpieza, vapores de disolventes. | Picos fantasma que absorben rayos UV, deriva de la línea base, cambios de retención |
| Iones inorgánicos | Sodio, cloruro, silicato, metales traza. | Cambios de conductividad, interferencia en cromatografía iónica y LC-MS, ensanchamiento de picos relacionado con metales |
| Partículas | Fines de resina, polvo, precipitados. | Fritas bloqueadas, contrapresión creciente, desgaste del sello de la bomba, línea base ruidosa |
| Gases disueltos | Oxígeno, dióxido de carbono, nitrógeno. | Burbujas en el detector, picos de referencia, variación del pH |
| Microorganismos | Bacterias y biopelículas en contenedores de almacenamiento. | Incrustaciones en la columna, fritas obstruidas, picos espurios, inestabilidad del método |
Estos efectos no son sólo teóricos. Una biopelícula microbiana en un depósito de agua puede liberar metabolitos que absorben los rayos UV y, una vez que se forma esa película, el simple hecho de reemplazar el agua puede no resolver el problema hasta que se limpie y desinfecte el depósito.
Lo que realmente significan "grado HPLC" y agua tipo 1
La mayoría de los métodos analíticos requieren agua que cumpla con las especificaciones del Tipo 1. En términos prácticos, eso significa que la resistividad a 25 grados Celsius es de aproximadamente 18,2 megaohmios-centímetro, la conductividad está cerca de 0,055 microsiemens por centímetro y el carbono orgánico total es lo suficientemente bajo como para que el agua no cree un fondo visible de UV o MS. La resistividad por sí sola no es suficiente. También necesita conocer el nivel de TOC, el recuento de partículas y, en algunas aplicaciones, los valores de silicato o sodio.
El pH del agua purificada no es una especificación útil. El agua ultrapura casi no tiene capacidad amortiguadora y absorbe rápidamente dióxido de carbono del aire, por lo que un pH medido alrededor de 5,6 simplemente refleja el CO2 disuelto. El pH que importa es el pH de la fase móvil tamponada que prepara.
Los requisitos de calidad del agua también dependen del detector. La detección UV a 210 nm es especialmente sensible a la contaminación orgánica porque allí se absorben muchos enlaces carbono-oxígeno y carbono-nitrógeno. LC-MS necesita agua con muy pocas impurezas no volátiles para evitar la supresión de iones y la formación de aductos. Los detectores evaporativos se ven igualmente afectados por la contaminación no volátil porque aumenta la señal de fondo. Por lo tanto, el agua tipo 1 es un buen punto de partida para casi todas las aplicaciones de HPLC.
El agua embotellada de calidad HPLC puede funcionar, pero debe almacenarse y manipularse correctamente. Verifique el certificado de análisis, registre el número de lote y nunca asuma que un contenedor viejo está libre de crecimiento biológico.
La elución en gradiente hace visibles las impurezas del agua
Las impurezas del agua son más visibles en los métodos de gradiente. En un proceso isocrático, un contaminante que absorba los rayos UV puede simplemente elevar un poco la línea de base. En un gradiente, la fracción de agua comienza alta y la fracción de disolvente orgánico aumenta con el tiempo. Los contaminantes pueden retenerse en la cabeza de la columna y luego eluirse a medida que aumenta el contenido orgánico. Esto produce picos fantasma y una línea de base a la deriva que puede interferir con la integración y la cuantificación.
Por eso, un gradiente en blanco es una de las comprobaciones más sencillas de la calidad del agua. Ejecute su gradiente exacto sin inyectar una muestra. Si aparecen picos en el espacio en blanco, se sospecha de la fase móvil.
Hábitos diarios que protegen la pureza del agua
El agua pura no permanece pura por accidente. Los siguientes hábitos previenen los problemas más comunes en la práctica de HPLC.
- Utilice agua de un sistema de purificación con cartuchos nuevos, una lámpara UV que funcione y desinfección periódica.
- Recoja el agua en un recipiente limpio y tapado. No deje el contenedor abierto mientras el sistema esté en funcionamiento.
- No almacene agua durante días. Prepare la fase móvil con agua dulce el mismo día siempre que sea posible.
- Evite agregar agua dulce a un depósito parcialmente lleno. Reemplace el contenido del depósito en lugar de rellenarlo.
- Ejecute un gradiente en blanco en la longitud de onda utilizada para el análisis y registre el resultado.
- Documente la resistividad, el TOC y la fecha de recolección de agua en sus registros analíticos.
Para los laboratorios que utilizan agua embotellada, se aplican las mismas reglas. Verifique la fecha de vencimiento, cierre el recipiente inmediatamente después de su uso y no devuelva el agua no utilizada del vaso de precipitados a la botella.
Los aditivos convierten un problema del agua en un problema de método
Las fases móviles rara vez contienen agua sola. Se añaden sales tampón, ácidos, reactivos de pares iónicos y algunos modificadores especializados en concentraciones relativamente bajas. Si el agua contiene trazas de impurezas que absorben los rayos UV, es posible que esas impurezas no cambien la capacidad del buffer, pero aún pueden aparecer en la señal del detector.
A veces se utilizan líquidos iónicos como modificadores de la fase móvil para mejorar la forma o la selectividad de los picos. Cuando elige uno, debe aplicarse el mismo estándar de pureza. Por ejemplo, Tetrafluoroborato de 1-etil-3-metilimidazolio es un líquido iónico común para estudios cromatográficos. Debe disolverse en agua que ya cumpla con las especificaciones del Tipo 1; de lo contrario, el aditivo se convierte en otra fuente de contaminación. Si desea comprender las propiedades relacionadas con la separación de estos compuestos, nuestro Descripción general de cómo se comportan los líquidos iónicos en los procesos de separación. cubre las variables prácticas.
CAS:143314-16-3 -1 -Proveedor de líquidos de tetrafluoroborato de etil-3-metilimidazolio Ldet Technology es un proveedor personalizado de líquidos de tetrafluoroborato de etil-3-metilimidazolio CAS: 143314-16-3 -1 y 1 -etil-3-metilim... Ver producto → La pureza comienza con el proveedor
En Zhejiang Ldet fabricamos líquidos iónicos y productos químicos especiales. Sabemos por la producción que un rastro de impureza en un material de partida puede cambiar el rendimiento posterior. Por eso comprobamos el contenido de agua, los haluros residuales y el comportamiento de los rayos UV antes de su liberación. La misma disciplina pertenece a un laboratorio de HPLC: elegir materiales que vengan con especificaciones documentadas. Por ejemplo, Tetrafluoroborato de 1-butil-3-metilimidazolio está disponible con datos de pureza que le permiten evaluar si es compatible con su método de detección.
CAS: 174501-65-6-1-Butil-3-metilimidazolio tetrafluoroborato Líquidos Proveedores Ldet Technology es CAS personalizado de China: 174501-65-6-1-Butil-3-metilimidazolio tetrafluoroborato Proveedores de líquidos y 1-Butil-3-metilimida... Ver producto → Qué comprobar en un certificado de análisis
- Contenido de haluros residuales, porque los haluros pueden afectar las separaciones por intercambio iónico y la corrosión.
- Contenido de agua, porque el agua cambia la concentración efectiva del aditivo.
- Un espectro UV o un límite UV, para que pueda predecir la absorbancia del fondo.
- Coherencia entre lotes, porque un nuevo lote no debería cambiar silenciosamente su método.
Si necesita ayuda para relacionar un material con un método, puede Discuta los datos de pureza y los requisitos personalizados con nuestro equipo técnico. .
Trate el agua como parte del método
La pureza del agua en HPLC no es una configuración única. Es una variable diaria que puede cambiar según la temporada, la botella de almacenamiento y el estado del sistema de purificación. Utilice agua tipo 1, confirme el TOC y la resistividad, manipúlela adecuadamente y elija aditivos con trazabilidad. En un método basado en nanogramos de analito, el agua nunca es "solo agua".
